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Jun 08, 2023

Variação transcricional em Babesia gibsoni (isolado de Wuhan) entre culturas in vivo e in vitro em estágio sanguíneo

Parasitas e vetores volume 16, número do artigo: 268 (2023) Citar este artigo 1 Detalhes da Altmetric Metrics Babesia gibsoni, agente causador da babesiose canina, pertence ao filo Apicomplexa.

Parasitas e Vetores volume 16, Número do artigo: 268 (2023) Citar este artigo

1 Altmétrico

Detalhes das métricas

Babesia gibsoni, agente causador da babesiose canina, pertence ao filo Apicomplexa. O desenvolvimento da tecnologia de cultura in vitro impulsionou o progresso da pesquisa em vários tipos de estudos ômicos, incluindo a análise transcriptômica de Plasmodium spp. entre ambientes in vitro e in vivo, o que levou à observação de antígenos diagnósticos e ao desenvolvimento de vacinas. No entanto, não há informações sobre Babesia spp. poderia ser obtido a este respeito, o que dificulta enormemente a compreensão adicional do crescimento e desenvolvimento do parasita na fase sanguínea.

Neste estudo, foram observadas mudanças consideráveis ​​na morfologia e infectividade de B. gibsoni cultivado in vitro (isolado de Wuhan) em comparação com parasitas in vivo. Com base nessas alterações, B. gibsoni (isolado de Wuhan) foi coletado de culturas in vivo e in vitro, seguido de extração de RNA total e sequenciamento do transcriptoma Illumina. Os genes diferencialmente expressos (DEGs) adquiridos foram validados usando qRT-PCR e depois anotados funcionalmente através de vários bancos de dados. O gene com maior regulação positiva após cultura in vitro foi clonado a partir do genoma de B. gibsoni (isolado de Wuhan) e caracterizado por western blotting e ensaio de imunofluorescência indireta para detecção da forma nativa e localização celular.

Através do cultivo em laboratório, foram observadas múltiplas formas de parasitas, e a infectividade dos parasitas cultivados in vitro em cães foi menor. Com base nessas alterações, o sequenciamento do transcriptoma Illumina foi conduzido, mostrando que 377 unigenes foram regulados positivamente e 334 unigenes foram regulados negativamente. Notavelmente, uma família de fatores de transcrição AP2, essencial para todos os estágios de desenvolvimento dos parasitas, foi rastreada e as alterações transcricionais nesses membros da família foram testadas. Assim, foi selecionado o novo gene do fator de transcrição AP2 (BgAP2-M) com a maior expressão regulada positivamente após adaptação in vitro. Este gene compreende um quadro de leitura aberto (ORF) de 1989 pares de bases que codifica uma proteína completa de 662 aminoácidos. BgAP2-M contém um domínio AP2 e um domínio conservado ACDC, que pode estar envolvido na biologia nuclear de parasitas. Os anticorpos policlonais preparados contra os peptídeos BgAP2-M detectaram ainda um tamanho nativo de ~ 73 kDa e foram localizados nos núcleos de B. gibsoni.

Este estudo apresenta pela primeira vez uma análise completa do transcriptoma de B. gibsoni in vivo e in vitro, contribuindo para uma compreensão detalhada dos efeitos das mudanças ambientais no crescimento e desenvolvimento de parasitas no estágio sanguíneo. Além disso, também fornece uma investigação mais profunda para os diferentes membros da família do fator de transcrição ApiAP2 como vários reguladores do estágio de vida em Babesia spp.

As espécies de Babesia são hemoprotozoários intraeritrocíticos obrigatórios que são taxonomicamente classificados no filo Apicomplexa, classe Piroplasmea, ordem Piroplasmida e família Babasidae [1,2,3]. Babesia gibsoni é um parasita hemoprotozoário que causa sintomas típicos da babesiose canina, como anemia hemolítica, hemoglobinúria, choque hipotensivo e morte [4,5,6]. Este organismo também é transmitido transovarianamente por Haemaphysalis longicornis, que é amplamente distribuído em áreas selvagens montanhosas [7,8,9,10].

Sistemas laboratoriais de cultura in vitro foram estabelecidos para vários parasitas apicomplexos, incluindo Babesia bovis, B. bigemina, B. gibsoni, B. orientalis, Plasmodium falciparum e P. knowlesi [11,12,13,14,15]. Devido a vários fatores ambientais in vitro, incluindo fatores físicos, nutricionais e imunológicos, que são distintos daqueles in vivo, os parasitas tendem a apresentar alterações visíveis e significativas na morfologia, infectividade e virulência. Por exemplo, no isolado de B. gibsoni Oita, o cultivo in vitro de longo prazo resultou em parasitas maiores e multiformados nos eritrócitos do hospedeiro e menor infectividade do parasita em cães [13, 16]. Conseqüentemente, as mudanças transcricionais mais profundas são consideradas provocadoras e significativas. No entanto, tais alterações nos genes afetados pela cultura in vitro foram investigadas tanto em P. falciparum quanto em P. knowlesi [17,18,19,20]. Tais alterações ocasionalmente significam adaptação dos parasitas ao ambiente circundante, produzindo melhor sobrevivência e propagação [21]. Por exemplo, alguns genes do estágio sexual (antígeno gameta 27/25) e outros relacionados à invasão e crescimento do estágio assexuado (MSP7, DOC2 e CLAMP) foram identificados com variações de transcrição relativamente grandes porque têm muito menos probabilidade de serem transmitidos. a novos vetores de mosquitos e com maior probabilidade de invadir os eritrócitos do hospedeiro em ambientes in vitro [17, 19]. Notavelmente, vários fatores de transcrição ApiAP2 também sofreram algum grau de alteração transcricional. Esta família de proteínas, com um a três domínios de ligação ao DNA, foi determinada como a maior família de fatores de transcrição em organismos apicomplexos e regula com precisão todos os estágios de desenvolvimento dos parasitas [22, 23]. Em P. falciparum, dois fatores de transcrição AP2, PF3D7_1222600 (PfAP2-G) e PF3D7_1222400 (PfAP2-G4), foram bem documentados como tendo mutações sem sentido de perda de função com códons de parada prematuros, levando a uma tremenda repressão da transcrição gênica durante a gametocitogênese . Outro fator de transcrição AP2 (PF3D7_1342900, PfAP2-HS) foi detectado com três mutações sem sentido, todas residindo a montante dos domínios AP2 previstos e truncando a proteína completa. Essas mutações afetadas pela transcrição em PfAP2-HS provavelmente resultaram de uma melhor tolerância às flutuações de temperatura em ambientes in vitro [18]. Além disso, estudos recentes observaram níveis aumentados de transcritos de um gene AP2 de função desconhecida (PF3D7_0420300), que pode estar envolvido na reprodução assexuada [19].