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Jul 16, 2023

A fixação de metanol é o método de escolha para gotículas

Biologia das Comunicações, volume 6, número do artigo: 522 (2023) Citar este artigo 1918 Acessos 24 detalhes de Altmetric Metrics Uma correção do editor para este artigo foi publicada em 13 de junho de 2023 Este

Biologia das Comunicações, volume 6, número do artigo: 522 (2023) Citar este artigo

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Uma correção do editor para este artigo foi publicada em 13 de junho de 2023

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O principal passo crítico na transcriptômica unicelular é a preparação da amostra. Vários métodos foram desenvolvidos para preservar células após a dissociação para desacoplar o manuseio de amostras da preparação da biblioteca. No entanto, a adequação destes métodos depende dos tipos de células a serem processados. Neste projeto, realizamos uma comparação sistemática de métodos de preservação para RNA-seq unicelular baseado em gotículas em células neurais e gliais derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas. Nossos resultados mostram que embora o DMSO forneça a mais alta qualidade celular em termos de moléculas de RNA e genes detectados por célula, ele afeta fortemente a composição celular e induz a expressão de genes de estresse e apoptose. Em contraste, as amostras fixadas em metanol apresentam uma composição celular semelhante às amostras frescas e proporcionam uma boa qualidade celular e poucos vieses de expressão. Tomados em conjunto, nossos resultados mostram que a fixação de metanol é o método de escolha para a realização de experimentos de transcriptômica unicelular baseados em gotículas em populações de células neurais.

Os métodos de transcriptômica unicelular (scRNA-seq) revolucionaram a maneira como estudamos de maneira de alto rendimento a expressão de genes em indivíduos, tecidos e até mesmo em doenças . Anteriormente, os estudos limitavam-se a identificar alterações nos níveis de expressão de genes em massa, ou seja, na população de células que compunham uma determinada amostra. Assim, estas abordagens misturaram dois efeitos diferentes: alterações na composição celular da amostra de interesse e alterações na expressão de genes dentro de células individuais. Agora, o scRNA-seq permite avaliar esses dois efeitos de forma independente e pode detectar tanto alterações na composição celular4,5 quanto na expressão de genes em tipos celulares específicos6,7.

Apesar da popularidade dos métodos scRNA-seq, ainda existem vários desafios técnicos não resolvidos. Por exemplo, a dissociação das células de um tecido e a obtenção de uma boa suspensão celular, necessária para scRNA-seq, é altamente específica do tecido e pode exigir o uso de diferentes estratégias, incluindo digestão enzimática, desagregação mecânica, células ativadas por fluorescência. triagem e outras tecnologias8,9,10,11,12. Como resultado, a preparação de amostras para scRNA-seq pode levar várias horas, o que torna mais conveniente processá-las em momentos posteriores. Além das dificuldades técnicas, a preservação celular também é importante se precisarmos dissociar a dissociação e o processamento de amostras por outros motivos, como o envio de amostras para uma instalação externa, ou se quisermos coletar múltiplas amostras e processá-las juntas posteriormente. para economizar tempo ou dinheiro. Em todos estes casos, os investigadores gostariam de preservar estas amostras de uma forma que minimizasse as diferenças na composição celular e na expressão genética de células individuais em comparação com a amostra original. Ou seja, o melhor método de preservação será aquele que tiver menor impacto na composição celular da amostra e no perfil transcriptômico das células individuais.

Vários métodos de preservação celular já foram desenvolvidos para superar esse problema e desacoplar o manuseio de amostras da preparação da biblioteca. Entre eles, encontramos soluções caseiras e comerciais, incluindo fixação de metanol13,14, propionato de ditio-bis succinimidil15, criopreservação de dimetilsulfóxido (DMSO)16,17, metanol acético (ACME)10, paraformaldeído18, CellCover17 e vivoPHIX19. Esses métodos visam manter a composição da amostra e a qualidade do RNA das células. No entanto, considerando que a preparação da amostra é específica do tecido, esperamos que diferentes métodos de preservação possam ser ideais para diferentes amostras. Muitos destes protocolos foram testados apenas em linhas celulares ou células de fácil obtenção, como células do sangue periférico e, portanto, não está claro como é o seu desempenho em células que são difíceis de dissociar ou que são potencialmente danificadas durante a dissociação. Em particular, nenhum dos métodos anteriores foi testado em neurônios maduros ou em neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSC), que são a principal fonte de células neurais para estudar os mecanismos moleculares que impulsionam as doenças neurológicas .