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Aug 09, 2023

Desafios e soluções no design de ensaios PCR

Crédito: Sebastian Condrea / Getty Images Projetar ensaios de PCR reproduzíveis envolve a otimização de múltiplos alvos móveis, desde a padronização de cada componente em volumes de reação às vezes diminutos até

Crédito: Sebastian Condrea/Getty Images

Projetar ensaios de PCR reproduzíveis envolve a otimização de vários alvos móveis, desde a padronização de cada componente em volumes de reação às vezes mínimos até o planejamento antecipado para garantir o armazenamento seguro e de longo prazo de reagentes, amostras e produtos de PCR.

Apreciar as complexidades e os desafios comuns envolvidos no desenvolvimento e otimização de testes de diagnóstico baseados em PCR ajudará os pesquisadores a superar esses obstáculos usando as soluções mais recentes disponíveis. Aqui discutimos alguns dos desafios comuns que os pesquisadores podem encontrar ao projetar um ensaio de diagnóstico molecular baseado em PCR e algumas soluções potenciais.

Um dos primeiros desafios encontrados ao projetar uma reação de PCR é escolher a polimerase ideal para a aplicação. É fundamental pesar suas necessidades no contexto das características da amostra biológica, do comprimento da sequência a ser amplificada e da precisão desejada da sequência do produto amplificado.

Gerald Hunter, PhD, cientista de aplicação de campo da Fortis Life Sciences, que tem vasta experiência na otimização de ensaios de PCR, afirma: “Diferentes DNA polimerases têm diferentes especificidades, funções enzimáticas, taxas de erro (fidelidades) e tolerância a inibidores de PCR”.

Projetar primers que se ligam aos modelos de DNA a uma temperatura pretendida com alta especificidade e otimizar a composição da mistura de reação apresenta os próximos desafios.

“O sucesso na PCR é baseado na capacidade da sua reação de manter uma baixa proporção de ligação de primers inespecíficos e, portanto, a temperatura de recozimento se torna um fator crítico que deve ser otimizado”, diz Hunter. “Além disso, os componentes do tampão de PCR – pH, sal, Mg2+, primer e concentração de enzima, que desempenham um fator no desempenho da reação – devem ser considerados e podem exigir otimização.”

A amplificação inespecífica geralmente ocorre quando os primers se ligam a sequências para as quais não foram projetados. Isso resulta em produtos não intencionais.

“O design de Primer é uma arte e uma ciência. Não só é importante a concentração correta do primer, mas também ter a sequência correta do primer”, diz Hunter. “Felizmente, existem muitas ferramentas de software de design de primers on-line gratuitas que podem ser usadas para o design de primers PCR, mas não se surpreenda se precisar testar alguns conjuntos de pares de primers antes de encontrar a combinação certa.”

Uma maneira de evitar a amplificação inespecífica é preparar a mistura de reação em gelo até estar pronto para inserir o tubo ou tira de PCR no termociclador. A baixa temperatura reduz a atividade da DNA polimerase, diminuindo a probabilidade de ligação imprecisa dos primers. Apesar desta precaução, produtos indesejados ainda podem ser sintetizados.

Uma solução adicional para combater a amplificação inespecífica é usar uma DNA polimerase de inicialização a quente. A DNA polimerase hot-start é quimicamente modificada para ser inativa à temperatura ambiente e evita amplificação inespecífica. Os nucleotídeos só são unidos pela enzima modificada depois que ocorre uma etapa de ativação por calor. Isto permite a montagem da reação de PCR à temperatura ambiente, sem possibilidade de produtos espúrios e formação de dímeros de primers. Uma vantagem adicional da PCR de início a quente é que as condições do ciclo de reação sem ativação por calor podem ser usadas como controle negativo.

A multiplexação é a capacidade de detectar uma série de condições ou fatores em um único teste, em vez de realizar testes individuais para cada parâmetro.1 Ela beneficia o rendimento, reduz os custos dos testes e melhora a eficiência do atendimento ao paciente.

A multiplexação é frequentemente desafiada pelo design do primer. Primers para PCRs multiplex devem ser altamente seletivos para sequenciamento alvo com temperaturas de fusão consistentes que produzam amplicons de comprimento uniforme. Isto requer cálculos cuidadosos ao projetar primers. Se projetados incorretamente, os primers formam homo ou heterodímeros ou amplificam sequências fora do alvo.